植物总RNA的提取及RT-PCR(2)

生物学实验技术

摇匀，加入100 l三氯甲烷，摇匀。

（3） 12000 rpm 4℃离心20 min，吸取上清，加入等体积异丙醇，于冰上放置15 min。

（4） 12000 rpm 4℃离心10 min，将沉淀悬浮于含100 l 4M氯化锂的1.5 ml EP管

中，于-20℃放置1小时或更长时间。

（5） 12000 rpm 4℃离心10-15 min，将沉淀溶于0.4 ml DEPC水中，加入1/2体积

氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min。

（6） 上清液加入1/10体积的3 M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20℃放置1小时或

更长时间。

（7） 12000 rpm 4℃离心15 min，超净台吹干，沉淀溶于10 l b灭菌的DEPC水中。

（8） RNA贮于-80℃。

（二）RNA反转录产生cDNA

在DEPC处理过的离心管中冰上按下表加入：

模板RNA

Olig(dT)18

DEPC 水 2 µl 1 µl 2 µl

混匀，70℃水浴中放置2 min，立即放置到冰上2 min。然后在冰上依次加入：

RNasin

M－MLV

5×buffer

10 mM dNTP 0.5 µl 1 µl 2 µl 1.5 µl

42℃，水浴中反应90 min。72℃，10 min，终止反应。

加入15 µl的DEPC灭菌水，使总体积达到25 µl。

(三) PCR

1. 在灭菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反应体系

10 X buffer 2.5 µl

dNTP (2.5 mmol) 2 µl

RT-PCR产物 5 µl

Taq酶 0.5 µl

上游引物（10 µmol/l） 0.5 µl

下游引物（10 µmol/l） 0.5 µl

灭菌ddH2O加到25 µl

2. 按照下列条件进行PCR反应

94℃ 5 min

94℃ 30 s

55℃ 30 s

72℃ 1 min

30个循环

72℃ 7 min

4℃

（四）电泳检测

将加EB的1 %变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×TE电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA及DNA样品加到凝胶点样孔中， 85 V条件下电泳30 min，在紫

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