德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效力研究(16)

德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及火活疫茁保护效力研究

（１～３）菌株与发病猪的死亡有关。此外，虽然危害美国猪场的副猪嗜血杆菌主要为血清型４的菌株，但经ＥＲＩＣ－ＰＣＲ检测，每个猪场都有一个不同的流行菌株。采用ＥＲＩＣ—ＰＣＲ对副猪嗜ｍ杆菌进行基因分型，要求使用细菌纯培养，抗生素的运用和该菌不易培养的特性都可能影响从临床病料分离这种细菌。

１．３．４重复序列ＰＣＲ（ｒｅｐ—ＰＣＲ）

重复序列ＰＣＲ（ｒｅｐ—ＰＣＲ）己被用于描述副猪嗜血杆菌分离菌株的多样性以及猪场内和猪场间副猪嗜血杆菌感染的流行病学研究。ｒｅｐ—ＰＣＲ的原理是：设计与散在的重复序列互补的外向寡核普酸引物，进行ＰＣＲ对这些重复序列之间相应的不同长短ＤＮＡ序列进行扩增，产物经电泳后即可形成具有菌株特异性的ＤＮＡ指纹图谱。这些散在的重复序列中，有相当多的重复序列保存在不同种属的细菌，因此同一对引物可应用于多种不同的细菌。由于不同细菌菌株重复序列之间的ＤＮＡ序列长短不同，散在的重复序列探针和基因组指纹图谱可用于区分不同的细菌。自从ｒｅｐ—ＰＣＲ建立以后，重复性回文序列（ＲＥＰ）、ＥＲＩＣ以及ＢＯＸ序列已用于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌指纹图谱发获取ＥＲＩＣ—ＰＣＲ检测出相同血清型的菌株具有不同的基因型。

１．３．５限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）

现已建立一种聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）试验，作为副猪嗜血杆菌流行病学研究分型的另一种方法。以ＰＣＲ—ＲＦＬＰ法对编码转铁结合蛋白的基因ｈｔｐＡ进行分析从而对副猪嗜血杆前进行分型，结果表明１５种副猪嗜血杆菌标准菌株产生１２种不同的图谱。这些标准菌株中，血清型５、１２、１４和１５具有共同的酶切图谱。对１０１株副猪嗜血杆菌现场分离株的分型表现出３３种ＲＦＬＰ图谱，其中有１０株细菌与标准菌株产生的图谱一致。用琼脂扩散试验对６６个菌株进行血清型分型，发现其分属２５种ＲＦＬＰ群，表明在相同的血清型内具有遗传多样性，而２７株不能分型的菌株分属１４种不同的ＲＦＬＰ群。血清型与ＲＦＬＰ之间没有相关性。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分型最为流行（占所研究菌株的２０．８％），其中包括血清型４、５、１３和１５以及不能分型的菌株。ｌＯ

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