人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定(10)

荧光倒置显微镜：Ｎｉｋｏｎ，日本。

６孔，２４孔，９６孔细胞培养板：ＪｕｎＣｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ。

微量可调移液器：ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ公司，美国。

透射电镜（ＴＥＭ）：日立，日本。

流式细胞仪：ＢＤ，美国。

２主要培养液及试剂的配制

１．消化液（Ｏ．２５％胰蛋白酶．０．０１％ＥＤＴＡ混合液）：称取２９胰酶，加入ＰＢＳ２００ｍｌ

溶解，过滤除菌，即配成１％的胰酶，再称取ＥＤＴＡ２００ｍｇ。加入ＰＢＳ２００ｍｌ溶解，

过滤除菌，即配成Ｏ．Ｉ％ＥＤＴＡ，使用时取１％的胰酶２．５ｍｌ和０．Ｉ％ＥＤＴＡＩｍｌ。用ＰＢＳ

稀释成１０ｍｌ，即配制成Ｏ．２５％胰蛋白酶一０．０１％ＥＤＴＡ混合液。

２．６％ＨＥＳ：称取６９羟乙基淀粉，用１００ｍｉ０．９％ＮａＣＩ溶液溶解，用磁力搅拌器搅

拌至颗粒消失，再高压灭菌。

３．１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液：在１０００ｍｌ去离子水中加入ＤＭＥＭ干

粉ｌＯｇ，ＮａＨＣ０３３．３９，青霉素Ｏ．０６２９，链霉素Ｏ．１９，谷氨酰胺０．３９，Ｈｅｐｅｓ３．７５９，搅拌

均匀后调节ＰＨ值，无菌过滤后分装，每瓶加入ＦＢＳ，制成含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ

细胞培养液。

４．条件培养液：在１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液中加入

ＶＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ，ＩＧＦ一１２ｎｇ／ｍＬ，ｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍＬ，ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ。

二．方法

ｌ实验分组

根据培养细胞所用培养液不同，本实验分为两组：

１．诱导组：采用加有ＶＥＧＦ等生长因子的条件培养液培养细胞。

２．未诱导组：采用含１００６ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液培养细胞。

２脐血中单个核细胞的分离

采用６％羟乙基淀粉（ＨＥＳ）沉降法和Ｆｉｅｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ分层法联合应用。

１．在无菌条件下，取足月健康分娩新生儿的脐血。用含５０ｍｌ细胞保存液的血袋

收集，抗凝剂为Ｏ．６％复方枸橼酸钠血液保存液，ＡＣＤ．Ａ，在８ｈ内处理完。

２．按ｌ：４比例将６％ＨＥＳ和新鲜脐血混合，４＂Ｃ静置６０ｍｉｎ．

３．收集上层富含白细胞的血浆层，４＂１２，１５００ｆ／ｒａｉｎ离心１５ｍｉｎ。８

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