人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定(12)

透性，加入含Ｏ．５％ＢＳＡ的ＰＢＳ封闭４０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次。

２）加入兔抗人ＶＥＧＦＲ－２和ｖＷＦ的单克隆抗体，阴性对照组只加ＰＢＳ，３７＂Ｃ孵

育６０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次。

３）加入ＦＩＴＣ标记的山羊抗兔二抗，３ＴＣ孵育６０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎｘ３次，，荧

光显微镜下观察，亮绿色荧光细胞为阳性细胞。以不加一抗的培养细胞作空白对

照

（２）流式细胞仪分析：检测新鲜分离和培养７ｄ后细胞中ＣＤｍ阳性细胞。

１）培养７ｄ后的细胞用胰酶消化下来，ＰＢＳ洗涤。

２）约１×１０６个细胞沉淀中加入１００ｕＬ含０．５％ＢＳＡ的ＰＢＳ封闭。

３）加入１０ｕＬＰＥ－ＣＤｌ３３，混匀．使ＣＤｌ３３稀释成１：ｌｌ，４＂Ｃ避光孵育１０ｍｉｎ。

４）ＰＢＳ洗涤并重悬后，进行流式细胞仪ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂ．Ｄ）分析，计数１０５细胞，

ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析结果，同时以ＰＢＳ替代ＣＤｌ３３单抗作阴性对照。对照组用

鼠抗人同型ｌｇＧｌ型作对照。ＣＤｌ３３阳性细胞百分率通过矫正同型对照的百分率

计算。

３．透电镜观察将诱导组培养１４ｄ的细胞送上海医学院电镜室处理后，观察培养

１４ｄ时细胞的超微结构。

４．内皮细胞分泌ＮＯ功能检测：测定细胞培养液一氧化氮（Ｎｏ）含量。实验分

三组：诱导组、未诱导组、人成熟脐静脉内皮细胞组。将上述三组培养１４ｄ生长

状态良好的细胞，以１×１０９，／Ｌ的密度接种于六孔培养板内，每组６孔，另设空

白对照组，培养２４ｈ后收集各孔内培养液检测。检测使用ＮＯ检测试剂盒，购自

南京建成生物工程研究所，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，以分光光度计测

定。其原理是采用硝酸还原酶法特异性将培养液中ＮＯｒ还原为Ｎ０２＂，并测定Ｎ０２’

浓度，从而间接反应ＮＯ含量。

５统计学处理

结果以均数±标准差（一Ｘ±ｓ）表示，，Ｉ习ＳＰＳＳｉ０．Ｏ软件作统计学处理，ｐ＜０．０５

为有显著性差异，有统计学意义，组间比较应用ｔ检验。１０

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