重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化(2)

西北大学博士学位论文

中文摘要

本研究旨在建立一套完整的重组Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ生产类人胶原蛋白（ｈｕｍａｎ．１ｉｋｅｃｏｌｌａｇｅｎ．ＨＬＣ）的中试规模生产工艺，并通过对各单元操作从实验室规模到中试规模的放大研究，为进一步将该工艺放大到工业生产奠定基础。

重组Ｅｃｏｌｉ的高密度培养是ＨＬＣ生产过程的核心单元，其放大的成功与否直接关系到整个工艺过程。为了明确影响发酵过程的关键因素，从而选择合适的放大准则和方法，本文对发酵过程中二氧化碳和乙酸的影响进行了系统研究。

尽管有大量文献表明，二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ发酵有负面影响，然而关于二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ，特别是重组蛋白表达方面的定量研究却未见报道。本研究采用二氧化碳脉冲法首次考察了重组Ｅｃｏｌｉ生长不同阶段二氧化碳浓度对重组蛋白生产的影响。研究结果表明，当在分批培养阶段施加浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲时，细胞生长明显受到抑制；而在补料阶段引入该脉冲时，却引起了比生长速率的小幅上升；二氧化碳对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段，即在蛋白表达诱导阶段引入浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲３小时，则最终ＨＬＣ浓度下降３３．９％。尽管二氧化碳脉冲的浓度越高，作用时间越长，其相应的抑制或促进作用也越明显，但当二氧化碳脉冲浓度小于等于１０％时，对发酵过程却几乎没有影响。

然后，针对重组Ｅｃｏｌｉ发酵过程的关键问题一乙酸抑制作了系统研究。研究结果表明，在分批培养阶段乙酸对Ｅｃｏｌｉ细胞有明显的抑制作用，但在补料培养阶段，其影响却并不明显；而乙酸对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段。本文首次建立了这一评价重组Ｅｃｏｌｉ细胞生长不同阶段乙酸影响的方法。而建立该法的理论依据就是在葡萄糖饥饿阶段，重组Ｅｃｏｌｉ细胞可以利用乙酸。为此，本研究也首次讨论了在细胞生长不同阶段，利用葡萄糖饥饿以诱导乙酸吸收对发酵过程的影响。

在发酵放大过程中，合适的种子扩大培养过程的建立对于成功的放大也至关重要。为了建立最优的种子扩大培养过程，本研究考察了三级种子不同移种阶段和不同种子培养基浓度对发酵过程的影响。结果表明：在对数期后期移种，ＨＬＣ产率最高；另外，当种子培养基葡萄糖浓度为２０∥Ｌ时，其后发酵过程所需的培养时间较短，ＨＬＣ表达量较高，ＨＬＣ平均产率最高，达到０．５１８９／Ｌ／ｈ。

由乙酸的相关研究可知，乙酸对本表达体系具有较强的抑制作用，因而本研究建立了以控制乙酸产生为根本目的的溶氧探测补料技术，该技术具有很强的适应性，可在不

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