重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化(3)

中文摘要

同的环境中迅速得到发酵过程的最佳补料方案。采用溶氧探测补料技术，在实验室规模获得的最终细胞干重和ＨＬＣ浓度分别为６９．１９／Ｌ和１３．］ｇ，／Ｌ，该值与以前根据比生长速率优化的结果基本一致。而放大到中试规模时，尽管乙酸浓度和实验室规模基本相同，优化诱导时机后获得的ＨＬＣ表达水平也基本相同，但最终细胞干重和ＨＬＣ浓度有一定程度下降，分别为５１．７９／Ｌ和９．６９／Ｌ。

直接放大后ＨＬＣ产量下降的原因之一可能是不同规模发酵罐氧传递能力不同所致。针对该问题，通过测定不同规模发酵罐的体积氧传递系数，并建立了体积氧传递系数对操作参数（通气量、搅拌速度和装液量）的关联方程，使得不同规模的发酵罐在氧的传递方面具有可比性。实验室小规模发酵罐ｋＬａ值对操作参数的经验关联式为：

（ｋＬａ）Ｌ＝０．０１１１Ｑｎ３１８５ＮＬ５１３１ＶＬ以４８０３

中试规模发酵罐ｋＬａ值对操作参数的经验关联式为：

（ｋＬａ）Ｐ＝０．２６９０Ｑ０．２９８３Ｎ１．２７２７ＶＬｎ枷

最后，根据体积氧传递系数的关联方程，分别以ｋＬａ和ｐ＊ｋＬａ为放大基准进行放大。由于本发酵体系对二氧化碳较不敏感，中试规模（５００Ｌ）中加压操作得到了成功应用。即以ｐ＊ｋＬａ为放大基准进行放大规模的不诱导的分批．补料培养，最终获得的细胞干重为７７．９９／Ｌ，略低于实验室规模培养获得的细胞干重（８０．３９／Ｌ），也低于以ｋＬａ为放大基准获得的中试规模培养的最终细胞干重（９０．ｏｅｃｔ，）。但以ｐ＊ｋＬａ为基准放大，初始装液量（２８５Ｌ）远高于以ｋＬａ为基准放大时的初始装液量（１０５Ｌ）；诱导培养后，最终细胞干重达到６８．４９／Ｌ，最终ＨＬＣ浓度为１３．０９／Ｌ，基本同实验室规模。

此外，本文还建立了ＨＬＣ中试纯化工艺，并对其中影响蛋白收率和蛋白纯度的主要工艺单元：高压匀浆、沉淀、超滤及离子交换层析进行了放大研究。结果表明，高压匀浆不用改变任何操作参数可直接放大；超滤过程仅改变和膜面积相关参数也可得到满意的放大结果；对于沉淀单元，由于搅拌釜装置变化，在中试规模重新优化了沉淀时间：即沉淀７０ｍｉｎ后纯化效果最好；保持线速度恒定进行层析单元的放大也获得了较好结果。中试规模纯化工艺得到ＨＬＣ的纯度为９５．４％，收率为６５．４％，与实验室规模纯化结果相比（ＨＬＣ纯度与收率分别为９６．４％，７１．７％）仅略有下降。

关键词

重组大肠杆菌，类人胶原蛋白，二氧化碳脉冲，乙酸，氧传递，中试放大

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